DNAは通常の場合2本鎖として存在し、センス鎖とアンチセンス鎖の2本のポリヌクレオチド鎖からできています。両鎖はアデニン（A）とチミン（T）の間の水素結合、およびグアニン（G）とシトシン（C）の間の水素結合によって安定化しています。この水素結合の安定性は、温度や変性剤によって変化します。DNA配列中に塩基置換が生じると、その周辺のDNA配列の安定性は変化します。また、正常型のDNA断片（センス鎖をＢ、アンチセンス鎖をＤとして、B:Dと書く）と、その断片の一部に塩基置換の生じたDNA断片（B’:D’）を混合して加熱し、一旦変性させ、B、D、B’、D’という4本の1本鎖とした後冷却すると、それらは再会合して再び2本鎖となりますが、もとの組み合わせのB:DとB’:D’のほかに、B:D’、B’:Dの組み合わせもできます。新しくできた2本鎖DNA中では、塩基のミスマッチ（ＡとＴ、ＧとＣ以外の組み合わせ）が生じ、これらの2本鎖DNAはミスマッチのない2本鎖DNAに比べて不安定です。

DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドスラブゲル中でDNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法です。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に1本鎖へと解離します。このような部分的に解離したDNA断片の移動度は非常に遅くなり、解離部分の無い、完全な2本鎖DNA断片の移動度と差がつくので両者を分離できます。